Kryokonservierung ist ein ziemlich cooles Konzept... im wahrsten Sinne des Wortes. Es beinhaltet die Konservierung von Zellen und Geweben durch Senkung der Kerntemperatur auf bis zu -196 °C. Entgegen der landläufigen Meinung (und der wahnsinnig niedrigen Temperatur) werden Zellen bei der Kryokonservierung jedoch nicht wirklich "eingefroren". Sie werden vitrifiziert. Dank der laufenden Forschung und der Kryoprotektionsmittel kann dieser Prozess mit einer hohen Erfolgsquote durchgeführt werden. Das Problem liegt in der Wiedererwärmung der Zellen. Es geht nicht nur darum, die Überlebenschancen der Zellen insgesamt zu erhöhen, sondern auch darum, die Vorhersagbarkeit des Verhaltens und der Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Aufwärmen zu optimieren. Um Ihnen einige Details zu dieser komplizierten Aufgabe zu geben, werden wir in dem folgenden Artikel einige der Gründe erörtern, warum es schwierig ist, Zellen nach der Kryokonservierung wieder aufzuwärmen.
Wie funktioniert die Kryokonservierung?
Die Kryokonservierung ist ein Konservierungsverfahren, das seit Jahrzehnten in der Wissenschaft eingesetzt wird. Es funktioniert, indem die Kerntemperatur von Zellen auf etwa -196 °C gesenkt wird, ohne dass sich Eis bildet. Das Ergebnis? Die biologische Aktivität und die Stoffwechselrate werden (im Grunde) in der Zeit angehalten, und die Konservierung kann unbegrenzt fortgesetzt werden. Einzelne kryokonservierte Zellen (z. B. Stammzellen, Samenzellen, embryonale Zellen) und kryokonservierte Patienten werden in flüssigem Stickstoff gelagert, um diese Temperatur und diesen Konservierungszustand zu erhalten. Derzeit können einzelne kryokonservierte Zellen zur Verwendung wieder aufgewärmt werden; bei Patienten ist dies nicht möglich (mehr dazu später). Bevor wir weitermachen, wollen wir uns genauer ansehen, wie die Kryokonservierung eigentlich funktioniert.
Verglasung und Konservierung
Verglasung ist die Umwandlung einer Substanz in einen glasartigen, amorphen Zustand. Dies wird erreicht, indem die Blut- und Wasserpartikel im Körper durch Kryoschutzmittel (CPAs) ersetzt werden, die eine Art medizinisches Frostschutzmittel sind und die Bildung von Eiskristallen verhindern. Diese CPAs umgeben auch die verbleibende Flüssigkeit und verhindern, dass sie Eis bildet. Der Übergang in den verglasten Zustand findet bei etwa -125 °C statt, d. h. an dem Punkt, an dem die Zellen im Wesentlichen an Ort und Stelle "eingefroren" werden. Dieser Punkt wird gemeinhin als Glasübergangstemperatur bezeichnet.
Unabhängig von der Temperatur unter dem Gefrierpunkt werdendie Zellen nicht wirklich eingefroren, dadies ein gewisses Maß an Eisbildung (auch Zellschädigung genannt) voraussetzt. Stattdessen wird die Bewegung der Zellen bis zu einem Punkt verlangsamt, an dem sie sich in einem nahezu festen Zustand befinden und auf unbestimmte Zeit konserviert werden können. Die anschließende Kühlung (auf etwa -196 °C) dient der langfristigen Lagerung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Vitrifizierung die Gefrierschäden erheblich reduziert, was zu einer besseren Gesamtkonservierung des Körpers (und einzelner Zellen) beitragen kann.
Wiedererwärmung von Zellen nach der Kryokonservierung
Nachdem Sie nun ein grundlegendes Verständnis des Kühlprozesses haben, können wir uns mit der anderen Seite der Gleichung befassen. Im Moment gilt dies nur für einzelne Zellen wie Stammzellen, embryonale Zellen, Samenzellen, Eizellen, rote Blutkörperchen usw. Komplexere Organismen (ganze Menschen) sind eine andere Geschichte. In diesem Artikel werden wir den Aufwärmprozess für einzellige Organismen diskutieren.
Das Wiederaufwärmen einzelner Zellen nach der Kryokonservierung erfordert einen völlig anderen Ansatz als das Kühlen. Während die Abkühlung langsam und kontrolliert erfolgen muss, muss die Wiedererwärmung schnell erfolgen. Idealerweise sollte mit der Wiedererwärmung so schnell wie möglich begonnen werden, um die Zellen wieder zu stabilisieren und sie in den Normalzustand zu versetzen.
Der Wiedererwärmungsprozess
Der erste Schritt beim Wiederaufwärmen der Zellen besteht darin, die Kryoflaschen sicher (d. h. mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung) aus den Behältern mit flüssigem Stickstoff zu entnehmen.
Um eine Schädigung der Zellen und eine mögliche Rekristallisation während dieses Prozesses zu vermeiden, ist eine schnelle Erwärmung unerlässlich [1]. Nach der Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff werden die Zellen im nächsten Schritt wieder aufgewärmt, indem das Fläschchen sofort in ein Wasserbad gestellt wird, das nicht wärmer als 37 °C sein darf [3]. Höhere Temperaturen könnten zum Absterben der Zellen führen, zu niedrige Temperaturen können jedoch Probleme mit der Aufwärmgeschwindigkeit verursachen [1]. Es gibt noch andere Geräte, die ständig weiterentwickelt werden, die aber möglicherweise nicht so effektiv sind wie Wasserbäder.
Je schneller die kryokonservierten Zellen wieder aufgewärmt werden können, desto besser. Im Idealfall werden die Zellen in weniger als einer Minute wieder aufgewärmt. Ist dies nicht möglich, ist es besser, die Zellen bei der niedrigsten Temperatur zu halten, bis ein schnelles Wiederaufwärmen möglich ist, als ein langsames Wiederaufwärmen [2].
Die Zellen sollten nach dem Aufwärmen überwacht werden, um Anomalien oder Probleme, die bei der Kryokonservierung aufgetreten sind, festzustellen.
Herausforderungen bei der Wiedererwärmung einzelner Zellen
Stammzellen, Embryonen, Samenzellen, rote Blutkörperchen und andere Gewebe, die derzeit erfolgreich kryokonserviert werden, können ohne größere Schäden vitrifiziert, gelagert und wieder aufgewärmt werden , wenn die richtigen Techniken schnell genug durchgeführt werden. Leider gibt es dabei ein paar Herausforderungen.
Methodik
Eine der Herausforderungen beim Wiederaufwärmen nach der Kryokonservierung ist die Methodik. Es gibt etwa vier verschiedene Möglichkeiten: Wasserbad, Erwärmung von Hand, Perlenbad oder spezielle Geräte. Wasserbäder erhöhen das Risiko einer Kontamination der Zellen, die Erwärmung von Hand ist ziemlich unpraktisch und nicht sehr effizient, und Perlenbäder bieten keine so effiziente Wärmeübertragung wie Wasserbäder, bergen aber dennoch ein gewisses Kontaminationsrisiko. Spezielle Geräte sind oft die beste Option, da sie eine standardisierte Aufwärmmethode bieten, die angepasst, getestet und wiederholt werden kann. Allerdings sind diese Geräte immer noch recht teuer, und einige Geräte können nur ein Fläschchen auf einmal erwärmen, was ihre Kompatibilität mit dem schadlosen Erwärmen einer ausreichenden Anzahl von Zellen einschränkt [4].
Zelluläre Lebensfähigkeit
Die größte Herausforderung bei der Wiedererwärmung ist die Maximierung des zellulären Überlebens und des vorhersehbaren Zellverhaltens nach der Kryokonservierung [4]. Die Kryokonservierung birgt ein hohes Risiko des Zelltods, wenn sich intrazelluläres Eis bildet. Die Zugabe von Kryoschutzmitteln zum Gefriermedium verringert das Risiko, aber es kehrt während des Erwärmungsprozesses zurück. Verbringt die Zelle zu viel Zeit bei einer Gefriertemperatur, während die Kryoprotektoren entfernt werden, kann es zur Eisbildung kommen [5]. Deshalb ist es so wichtig, schnelle Wiederaufwärmtechniken anzuwenden.
Herausforderungen bei der Wiedererwärmung komplexer Zellen und Organismen
Die zelluläre Wiedererwärmung ist eine ganz andere Geschichte, wenn man den menschlichen Körper als Gesamtorganismus betrachtet. Aufgrund der zellulären Komplexität des Körpers gibt es derzeit keinen Wiedererwärmungsprozess. Theoretisch gesehen sind dies jedoch einige der Herausforderungen, denen sich ein Wissenschaftler beim Wiederaufwärmen eines kryokonservierten Patienten stellen würde.
Verschiedene Zellen erfordern unterschiedliche Aufwärmtemperaturen und -verfahren, um Schäden zu vermeiden. Dies wird von den Forschern noch erforscht. Bei der Kryokonservierung von Patienten besteht das Risiko der intrazellulären (inneren) Eisbildung auch interzellulär (zwischen den Zellen). Deshalb ist der Einsatz von Kälteschutzmitteln und Kühltechniken zur Erreichung eines glasähnlichen amorphen Zustands so wichtig - er reduziert die Bildung von Eiskristallen, was wiederum das Risiko von Schäden verringert. Bei der Umkehrung dieses Prozesses kann es jedoch wieder zu Problemen kommen. Einige Zellen im Körper können die optimale Temperatur vor anderen erreichen, was das Risiko der Eisbildung in den kälteren Teilen des Körpers erhöht. Da die CPAs während des Erwärmungsprozesses entfernt und durch Körperflüssigkeiten ersetzt werden, kann es sein, dass einige Bereiche in Ordnung sind, andere jedoch einfrieren.
Darüber hinaus sind bestimmte Verbindungen in den CPAs toxisch, so dass das Wiederaufwärmen verheerende Auswirkungen auf die gesamte Lebensfähigkeit der Zellen haben könnte, wenn es nicht möglich ist, Schäden im Voraus zu reparieren. Die Reparatur von Zellschäden und die Verringerung der Auswirkungen ungleichmäßiger Erwärmung sind einige der größten Hürden, die der Wiedererwärmung kryokonservierter Patienten im Wege stehen.
Potenzielle zukünftige Wiederbelebungstechnologien
Obwohl diese Technologie zur Wiederaufwärmung von Patienten nach der Kryokonservierung noch entwickelt werden muss, gibt es mehrere Möglichkeiten, die oben genannten Herausforderungen zu überwinden. Zwei dieser Ansätze sind die folgenden.
Konventionelle Zellreparatur
Während dieses Prozesses würde der vorgeschlagene Ansatz im Wesentlichen einen kryokonservierten Patienten scannen, während er noch vitrifiziert ist, und seine physische Struktur aufzeichnen [6]. Auf diese Weise würde sozusagen eine Körperkarte erstellt, um die Anordnung der Zellen und verschiedenen Systeme des Patienten im festen Zustand besser zu verstehen. Bei der Wiedererwärmung würde diese Karte dann die "schnelle Extraktion aller Stoffwechsel- und Abbaumoleküle und die rasche Herstellung einer vollständigen Biostase bei der höheren Temperatur" ermöglichen [6]. Auf diese Weise würde das übergreifende Problem der ungleichmäßigen Erwärmung gelöst und medizinischen Nanorobotern die Möglichkeit gegeben, subzelluläre Schäden zu beheben und Zellen in ihre ursprüngliche Struktur (oder besser) zurückzuführen [6].
Molekulare Rekonstruktion
Eine weitere vorgeschlagene Technologie, die bei der Wiedererwärmung komplexer Organismen helfen würde, ist die molekulare Rekonstruktion. Da kryokonservierte Patienten fest und für Nanoroboter undurchdringlich sind (was die Möglichkeit der zellulären Kartierung und Reparatur einschränkt), muss eine Möglichkeit zur Bewertung von Schäden und Strukturen entwickelt werden. Eine Möglichkeit dazu ist die Mechanosynthese - oder sehr gezielte chemische Reaktionen auf einem einzelnen Atom [6]. Dies würde es den Wissenschaftlern ermöglichen, jeweils ein Atom eines kryokonservierten Patienten zu analysieren, so dass die genaue Position und Identität aufgezeichnet wird [6]. Nachdem jedes Atom aufgezeichnet wurde, ergibt sich eine extrem detaillierte und genaue Karte der physischen Struktur des kryokonservierten Patienten - eine Karte, die 1000-mal detaillierter ist als die Karte, die sich aus der konventionellen Zellreparatur ergibt [6]. Die detaillierten Scans ermöglichen es, den Körper des Patienten nach der Wiedererwärmung zu rekonstruieren, so dass die Nanotechnologie notwendige Reparaturen vornehmen oder andere Technologien anwenden kann.
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Destruktiv vs. Nicht-destruktive Scans und Rekonstruktion
Wenn es die Technologie gäbe, könnte die Wiederbelebung nach dem Scannen des Körpers entweder durch konventionelle Zellreparatur oder durch molekulare Rekonstruktion erfolgen. Dies könnte durch die Dekonstruktion einzelner Atome oder durch eine stärker segmentierte Dekonstruktion erreicht werden.
Bei der Dekonstruktion eines einzelnen Atoms wird der Patient Atom für Atom zerlegt, wobei eventuelle Schäden oder medizinische Probleme auf dem Weg dorthin digital korrigiert werden [6]. Nachdem jedes ursprüngliche Atom aufgezeichnet wurde, wird es entsorgt. Nachdem alle Atome aufgezeichnet, korrigiert und hochgeladen wurden, könnte ein Ersatzkörper mittels kryogenem 3D-Druck hergestellt werden. Das Ergebnis? Eine fast völlig identische Kopie des ursprünglichen kryokonservierten Körpers des Patienten, nur besser [6].
Alternativ könnte der Körper kryokonservierter Patienten in Segmente zerlegt werden (und nicht Atom für Atom), so dass 99,99999 % des festen Körpers des Patienten bei der Bearbeitung der isolierten Segmente nicht beeinträchtigt werden [6]. Dieses Mapping-Verfahren ist zerstörungsfrei und ermöglicht Reparaturen und Korrekturen am ursprünglichen kryokonservierten Körper [6].
Fazit
Wie Sie sehen, ist der Prozess des Wiederaufwärmens und der Optimierung der zellulären Vitalität sehr viel verwirrender und theoretischer als das Wiederaufwärmen von Einzelzellen. Aufgrund dieser Herausforderungen ist die Kryokonservierung derzeit auf die aktuellen Anwendungen beschränkt. Mit der Weiterentwicklung der Technologie rückt jedoch die Wiedererwärmung komplexer Organismen - wie Organe oder sogar Patienten - in greifbare Nähe. Zwar gibt es derzeit noch nichts dergleichen, doch wer weiß, was in den nächsten 10 oder 100 Jahren geschehen wird.
Wenn wir Ihr Interesse am Thema Kryokonservierung geweckt haben und Sie mehr über die Funktionsweise erfahren möchten, vereinbaren Sie einen Gesprächstermin mit einem unserer Teammitglieder. Sie können auch unserer Mitgliedergemeinschaft beitreten, indem Sie sich noch heute anmelden!
Referenzen
[1] Laborakademie. (2020, Oktober 11). Wie man Zellen auftaut - Leitfaden für reproduzierbare Kryokonservierungsergebnisse - Eppendorf. Eppendorf.
[2] Baust, JM et al. Bewährte Verfahren für die Kryokonservierung, das Auftauen, die Rückgewinnung und die Bewertung von Zellen. In Vitro Zelluläre & Entwicklungsbiologie - Tier 2017.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29098516/
[3]ThermoFisher Scientific. (n.d.). Auftauen von Zellen - Gibco® Zellkultur-Grundlagen.
[4] Eppendorf. (2021). Cell Thawing Protocol Standardization-Guide for More Reproducible Cryopreservation Results (Nr. 60).
[5] Bojic, S. (2021, 24. März). Der Winter kommt: die Zukunft der Kryokonservierung - BMC Biology. BioMed Central.
https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-021-00976-8
[6] Freitas, R. A., & Fahy, G. M. (2022). Cryostasis Revival: Die Wiederherstellung von kryonik Patienten durch Nanomedizin (Erste Ausgabe). Alcor Life Extension Foundation.
