La criopreservación es un concepto muy interesante... literalmente. Consiste en preservar células y tejidos reduciendo la temperatura del núcleo hasta -196 °C. Sin embargo, contrariamente a la creencia popular (y a su temperatura increíblemente baja), la criopreservación no "congela" las células. Las vitrifica. Gracias a la investigación en curso y a los agentes crioprotectores, este proceso puede lograrse con un alto porcentaje de éxito. El problema radica en el recalentamiento de las células. Además de aumentar las posibilidades de supervivencia celular en general, es importante optimizar la previsibilidad del comportamiento y la viabilidad celulares tras el recalentamiento. Para ofrecerle algunos detalles sobre este complicado obstáculo, en el siguiente artículo analizaremos algunas de las razones por las que es difícil recalentar las células después de la criopreservación.
¿Cómo funciona la crioconservación?
La criopreservación es un proceso de conservación que se utiliza en el campo científico desde hace décadas. Funciona reduciendo la temperatura central de las células a unos -196 °C sin formación de hielo. ¿Cuál es el resultado? La actividad biológica y la tasa metabólica quedan (básicamente) suspendidas en el tiempo y la conservación puede continuar indefinidamente. Las células individuales que se criopreservan (es decir, células madre, espermatozoides, células embrionarias) y los pacientes criopreservados se almacenan en nitrógeno líquido para mantener esta temperatura y estado de conservación. Por ahora, las células singulares crioconservadas pueden volver a calentarse para su uso; los pacientes, no (más adelante hablaremos de ello). Antes de seguir adelante, veamos cómo funciona realmente la crioconservación.
Vitrificación y conservación
La vitrificación es la transformación de una sustancia en un estado amorfo similar al vidrio. Se consigue sustituyendo las partículas de sangre y agua del cuerpo por agentes crioprotectores (CPA), que son un tipo de anticongelante de uso médico que ayuda a impedir la formación de cristales de hielo. Estos CPA también rodean el líquido restante y evitan que se forme hielo. La transición al estado vitrificado se produce a unos -125 °C, más o menos, que es el punto en el que las células se "congelan" en su lugar. Es lo que se conoce como temperatura de transición vítrea.
Independientemente de la temperatura de congelación, las células no se congelan realmente, ya que esto implica cierto grado de formación de hielo (también conocido como daño celular). En cambio, el movimiento celular se ralentiza hasta un punto en el que se encuentran en un estado casi sólido y pueden conservarse indefinidamente. Posteriormente, se inicia el enfriamiento (a unos -196 °C) para el almacenamiento a largo plazo. En resumen, la vitrificación reduce sustancialmente los daños por congelación, lo que puede ayudar a mejorar la conservación general del cuerpo (y de las células individuales)..
Recalentamiento de las células después de la criopreservación
Ahora que ya tiene una comprensión básica del proceso de enfriamiento, podemos sumergirnos en el otro lado de la ecuación. Por ahora, esto sólo se aplica a células individuales como células madre, células embrionarias, espermatozoides, ovocitos, glóbulos rojos, etc. Los organismos más complejos (seres humanos enteros) son harina de otro costal. En este artículo hablaremos del proceso de recalentamiento de los organismos unicelulares.
El recalentamiento de células individuales después de la criopreservación requiere un enfoque totalmente diferente al del enfriamiento. Mientras que el enfriamiento debe producirse lentamente, a un ritmo controlado, el recalentamiento debe producirse rápidamente. Lo ideal es que el recalentamiento comience lo antes posible para volver a estabilizar las células y devolverlas a sus condiciones normales.
El proceso de recalentamiento
El primer paso para recalentar las células aplicables es retirar de forma segura (es decir, con el equipo de protección personal adecuado) los crioviales de su almacenamiento en tanques de nitrógeno líquido.
Para evitar el daño celular y la posible recristalización durante este proceso, es esencial un calentamiento rápido [1]. Una vez retiradas del nitrógeno líquido, el siguiente paso es recalentar las células colocando inmediatamente el vial en un baño de agua a una temperatura no superior a 37°C [3]. Las temperaturas más altas podrían provocar la muerte de las células, pero las temperaturas demasiado bajas pueden causar problemas con la velocidad de recalentamiento [1]. Hay otros dispositivos disponibles para su uso y se están desarrollando continuamente, pero podrían no ser tan eficaces como los baños de agua.
Cuanto más rápido se puedan recalentar las células criopreservadas, mejor. En situaciones ideales, las células se recalientan en menos de un minuto. Si esto no es posible, es preferible mantener las células a la temperatura más baja hasta que se pueda conseguir un recalentamiento rápido que un recalentamiento lento [2].
Las células deben ser controladas después de ser recalentadas para comprobar si hay anomalías o cualquier problema que se haya producido por la criopreservación.
Desafíos del recalentamiento de células individuales
Las células madre, los embriones, los espermatozoides, los glóbulos rojos y otros tejidos que actualmente se someten con éxito a procesos de crioconservación pueden vitrificarse, almacenarse y recalentarse sin sufrir grandes daños si se realizan las técnicas adecuadas con la suficiente rapidez. Por desgracia, esto plantea algunos problemas.
Metodología
Uno de los retos del recalentamiento tras la criopreservación es la metodología. Hay unas cuatro opciones diferentes: baño de agua, calentamiento manual, baño de microesferas o dispositivos especializados. Los baños de agua aumentan el riesgo de contaminación de las células, el calentamiento manual es poco práctico y no es muy eficiente, y los baños de microesferas no proporcionan una transferencia de calor tan eficiente como los baños de agua, pero aún conllevan un grado de riesgo de contaminación. Los dispositivos dedicados son a menudo la mejor opción, ya que producen un método de recalentamiento estandarizado que puede ser adaptado, probado y repetido. Sin embargo, siguen siendo bastante caros y algunos dispositivos sólo pueden recalentar un vial a la vez, lo que reduce su compatibilidad para recalentar suficientes células sin dañarlas [4].
Viabilidad celular
En última instancia, el mayor reto del recalentamiento es maximizar la supervivencia celular y el comportamiento predecible de las células después de la criopreservación [4]. La criopreservación supone un alto riesgo de muerte celular si se forma hielo intracelular. La adición de agentes crioprotectores al medio de congelación reduce el riesgo, pero éste regresa durante el proceso de calentamiento. Si la célula pasa demasiado tiempo a temperatura de congelación mientras se eliminan los crioprotectores, puede producirse la formación de hielo [5]. Por eso es tan importante utilizar técnicas de recalentamiento rápido.
Retos del recalentamiento de células y organismos complejos
El recalentamiento celular es una historia completamente diferente cuando se considera todo el cuerpo humano como un organismo completo. De hecho, debido a la complejidad celular que existe dentro del cuerpo, actualmente no existe un proceso de recalentamiento. Sin embargo, en teoría, es probable que estos sean algunos de los retos a los que se enfrentaría un científico al recalentar a un paciente crioconservado.
Diferentes células requieren diferentes temperaturas y procedimientos de recalentamiento para evitar daños. Esto es algo que todavía está siendo explorado por los investigadores. Al criopreservar a los pacientes, este riesgo de formación de hielo intracelular (dentro) se extiende también al intercelular (entre). Por eso es tan importante el uso de agentes crioprotectores y técnicas de enfriamiento para conseguir un estado amorfo similar al del vidrio: reduce la formación de cristales de hielo, lo que a su vez reduce el riesgo de daños. Sin embargo, cuando se invierte este proceso, pueden volver los problemas. Algunas células del organismo pueden alcanzar la temperatura óptima antes que otras, lo que aumenta el riesgo de formación de hielo en las partes más frías del cuerpo. Conceptualmente, como los CPA se eliminan y se sustituyen por fluidos corporales durante el proceso de calentamiento, algunas zonas pueden estar bien, pero otras pueden acabar congelándose.
Además, algunos compuestos de los CPA son tóxicos, por lo que el recalentamiento podría ser devastador para la viabilidad celular general si no se dispone de la tecnología necesaria para reparar los daños con antelación. Reparar el daño celular y reducir el impacto de un calentamiento desigual son algunos de los mayores obstáculos para recalentar a los pacientes criopreservados.
Posibles tecnologías de reanimación en el futuro
Aunque esta tecnología para recalentar a los pacientes después de la criopreservación aún no se ha desarrollado, se están explorando varias posibilidades para superar los retos mencionados. Dos de estos enfoques son los siguientes.
Reparación celular convencional
Durante este proceso, el método propuesto escanearía a un paciente crioconservado mientras está vitrificado y registraría su estructura física [6]. De este modo se crearía un mapa corporal, por así decirlo, para comprender mejor la disposición de sus células y diversos sistemas mientras aún se encuentran en estado sólido. Luego, durante el recalentamiento, este mapa permitiría la "extracción rápida de todas las moléculas metabólicas y degradativas y establecer rápidamente una biostasis completa a la temperatura más alta" [6]. Esto se haría para resolver el problema general del recalentamiento desigual y dar a los nanorobots médicos la oportunidad de restaurar el daño subcelular y devolver a las células su estructura original (o mejor) [6].
Reconstrucción molecular
Otra tecnología propuesta que ayudaría al recalentamiento de organismos complejos es la reconstrucción molecular. Dado que los pacientes criopreservados son sólidos e impenetrables para los nanorobots (lo que reduce las posibilidades de mapeo y reparación celular), es necesario desarrollar una forma de evaluar los daños y la estructura. Una forma de hacerlo es a través de la mecanosíntesis, es decir, reacciones químicas muy específicas de un solo átomo [6]. Esto permitiría a los científicos analizar un átomo de un paciente criopreservado a la vez, de modo que se registrara la ubicación e identidad precisas [6]. Una vez registrado cada átomo, el resultado es un mapa extremadamente detallado y preciso de la estructura física del paciente criopreservado, 1000 veces más detallado que el mapa resultante de la reparación celular convencional [6]. Los escaneos detallados permiten reconstruir el cuerpo del paciente tras el recalentamiento, de modo que la nanotecnología pueda realizar las reparaciones necesarias o aplicar otras tecnologías.
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Escaneos destructivos Vs. Escaneos no destructivos y reconstrucción
Si existiera la tecnología, la reanimación podría producirse después de escanear el cuerpo utilizando la reparación celular convencional o la reconstrucción molecular. Esto podría lograrse mediante la deconstrucción de átomos individuales o una deconstrucción más segmentada.
La deconstrucción de un solo átomo desmontaría al paciente átomo por átomo, corrigiendo digitalmente cualquier daño o problema médico en el camino [6]. Después de registrar cada átomo original, se descarta. A continuación, una vez registrados, corregidos y cargados todos los átomos, se podría fabricar un cuerpo de sustitución mediante impresión criónica en 3D. ¿El resultado? Una copia casi idéntica al cuerpo original criopreservado del paciente, pero mejor [6].
Como alternativa, el cuerpo de los pacientes criopreservados podría separarse en piezas segmentadas (en lugar de átomo por átomo), de modo que el 99,99999% del cuerpo sólido del paciente no se vea alterado mientras se procesan los segmentos aislados [6]. Este proceso de mapeo no es destructivo y permite realizar reparaciones y correcciones en el cuerpo original criopreservado [6].
Conclusión
Como puede ver, el proceso de recalentamiento y optimización de la vitalidad celular es mucho más confuso y teórico que el recalentamiento de células individuales. Por ahora, debido a estos retos, la criopreservación se limita a las aplicaciones actuales. Sin embargo, a medida que la tecnología siga avanzando, el recalentamiento de organismos complejos -como órganos o incluso pacientes- estará más cerca de ser una realidad. Aunque actualmente no existe nada parecido, quién sabe lo que ocurrirá en los próximos 10 o 100 años.
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Referencias
[1] Lab Academy. (2020, 11 de octubre). Cómo descongelar células - Guía para obtener resultados de criopreservación más reproducibles - Eppendorf. Eppendorf.
[2] Baust, JM et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells. Biología celular y del desarrollo in vitro. - Animal 2017.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29098516/
[3]ThermoFisher Scientific. (n.d.). Descongelación de células - Conceptos básicos de cultivo celular de Gibco.
[4] Eppendorf. (2021). Guía de estandarización del protocolo de descongelación celular para obtener resultados de criopreservación más reproducibles. (nº 60).
[5] Bojic, S. (2021, 24 de marzo). Se acerca el invierno: el futuro de la criopreservación - BMC Biology. BioMed Central.
https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-021-00976-8
[6] Freitas, R. A., & Fahy, G. M. (2022). Cryostasis Revival: The Recovery of criónica Patients through Nanomedicine. (Primera Edición). Alcor Life Extension Foundation.
