La crioconservazione è un concetto piuttosto interessante... letteralmente. Consente di preservare cellule e tessuti abbassando la temperatura interna fino a -196°C. Tuttavia, contrariamente a quanto si crede (e alla sua temperatura follemente bassa), criopreservazione non "congela" le cellule. Le vetrifica. Grazie alle ricerche in corso e agli agenti crioprotettivi, questo processo può essere realizzato con un'alta percentuale di successo. Il problema risiede nel riscaldamento delle cellule. Oltre ad aumentare le possibilità di sopravvivenza complessiva delle cellule, è importante ottimizzare la prevedibilità del comportamento e della vitalità cellulare dopo il riscaldo. Per fornire alcuni dettagli su questo complicato ostacolo, nell'articolo che segue discuteremo alcune delle ragioni per cui è difficile riscaldare le cellule dopo criopreservazione nell'articolo che segue.
Come funziona la crioconservazione?
La crioconservazione è un processo di conservazione utilizzato da decenni in campo scientifico. Funziona riducendo la temperatura del nucleo delle cellule a circa -196°C senza la formazione di ghiaccio. Il risultato? L'attività biologica e il tasso metabolico vengono (sostanzialmente) sospesi nel tempo e la conservazione può continuare indefinitamente. Le singole cellule che sono criopreservato (cioè cellule staminali, spermatozoi, cellule embrionali) e i pazienti criopreservato sono conservati in azoto liquido per mantenere questa temperatura e questo stato di conservazione. Al momento, le singole cellule criopreservato possono essere riscaldate per l'uso, mentre i pazienti non possono esserlo (per saperne di più). Prima di andare avanti, diamo un'occhiata più da vicino a come funziona criopreservazione .
Vitrificazione e conservazione
La vetrificazione è la trasformazione di una sostanza in uno stato amorfo simile al vetro. Si ottiene sostituendo le particelle di sangue e acqua presenti nel corpo con agenti crioprotettivi (CPA), che sono un tipo di antigelo di grado medico che aiutano a prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio. Questi CPA circondano anche i liquidi rimanenti e impediscono loro di formare ghiaccio. Il passaggio allo stato vetrificato avviene a circa -125°C, più o meno qualche grado, che è il punto in cui le cellule diventano essenzialmente "congelate". Questo valore viene comunemente indicato come temperatura di transizione vetrosa.
Indipendentemente dalla temperatura di congelamento, le cellule non vengono congelate, poichéciò implica un certo grado di formazione di ghiaccio (ovvero un danno cellulare). Al contrario, il movimento delle cellule viene rallentato fino a raggiungere uno stato quasi solido e può essere conservato a tempo indeterminato. Il successivo raffreddamento (fino a circa -196°C) viene avviato per a lungo termine conservazione. In sintesi, la vitrificazione riduce sostanzialmente i danni da congelamento, il che può contribuire a migliorare la conservazione complessiva del corpo (e delle singole cellule).
Riscaldare le cellule dopo la crioconservazione
Ora che si è acquisita una conoscenza di base del processo di raffreddamento, possiamo addentrarci nell'altro lato dell'equazione. Per ora, questo vale solo per singole cellule come cellule staminali, cellule embrionali, spermatozoi, ovociti, globuli rossi, ecc. Gli organismi più complessi (interi esseri umani) sono una storia diversa. Per il bene di questo articolo, discuteremo il processo di riscaldamento per gli organismi unicellulari.
Riscaldare le singole cellule dopo criopreservazione richiede un approccio completamente diverso rispetto al raffreddamento. Mentre il raffreddamento deve avvenire lentamente, a una velocità controllata, il riscaldo deve avvenire rapidamente. L'ideale sarebbe iniziare il riscaldamento il prima possibile per stabilizzare le cellule e riportarle alle condizioni normali.
Il processo di riscaldamento
Il primo passo per riscaldare le cellule applicabili consiste nel rimuovere in modo sicuro (cioè con l'appropriato equipaggiamento protettivo personale) le crioviali dal loro conservazione nei serbatoi di azoto liquido.
Per evitare danni alle cellule e una potenziale ricristallizzazione durante questo processo, è essenziale un rapido riscaldamento [1]. Una volta rimosse dall'azoto liquido, la fase successiva consiste nel riscaldare le cellule ponendo immediatamente la fiala in un bagno d'acqua non più caldo di 37°C [3]. Temperature superiori a questa potrebbero portare alla morte delle cellule, mentre temperature troppo basse possono causare problemi con la velocità di risveglio [1]. Sono disponibili altri dispositivi e sono in continuo sviluppo, ma potrebbero non essere efficaci come i bagni d'acqua.
Quanto più velocemente si possono riscaldare le cellule di criopreservato , tanto meglio è. In situazioni ideali, le cellule vengono riscaldate in meno di un minuto. Se ciò non è possibile, è preferibile mantenere le cellule alla temperatura più bassa fino a quando non è possibile ottenere un riscaldamento rapido piuttosto che un riscaldamento lento [2].
Le cellule devono essere monitorate dopo il riscaldamento per verificare l'eventuale presenza di anomalie o di problemi dovuti a criopreservazione.
Le sfide del riscaldamento di singole cellule
Le cellule staminali, gli embrioni, gli spermatozoi, i globuli rossi e altri tessuti che attualmente sono sottoposti a processi di successo criopreservazione possono essere vetrificati, conservati e riscaldati senza danni, se le tecniche appropriate vengono eseguite abbastanza rapidamente. Sfortunatamente, ci sono alcune sfide da affrontare.
Metodologia
Una delle sfide del riscaldo dopo criopreservazione è la metodologia. Esistono circa quattro opzioni diverse: bagno d'acqua, riscaldamento manuale, bagno di microsfere o dispositivi specializzati. I bagni d'acqua aumentano il rischio di contaminazione delle cellule, il riscaldamento manuale è piuttosto poco pratico e poco efficiente, mentre i bagni di microsfere non forniscono un trasferimento di calore così efficiente come i bagni d'acqua, ma comportano comunque un certo rischio di contaminazione. I dispositivi dedicati sono spesso l'opzione migliore, in quanto producono un metodo di riscaldamento standardizzato che può essere adattato, testato e ripetuto. Tuttavia, questi dispositivi sono ancora piuttosto costosi e alcuni possono riscaldare solo una fiala alla volta, riducendo la loro compatibilità a riscaldare un numero sufficiente di cellule senza danni [4].
Vitalità cellulare
In definitiva, la sfida più grande del riscaldo consiste nel massimizzare la sopravvivenza cellulare e il comportamento prevedibile delle cellule dopo criopreservazione [4]. La crioconservazione comporta un rischio elevato di morte cellulare in caso di formazione di ghiaccio intracellulare. L'aggiunta di agenti crioprotettivi al mezzo di congelamento riduce il rischio, che però si ripresenta durante il processo di riscaldamento. Se la cellula trascorre troppo tempo a una temperatura di congelamento mentre i crioprotettori vengono rimossi, può verificarsi la formazione di ghiaccio [5]. Per questo motivo è importante utilizzare tecniche di riscaldamento rapido.
Le sfide del riscaldamento di cellule e organismi complessi
Il riscaldamento cellulare è una storia completamente diversa se si considera l'intero corpo umano come un organismo completo. Infatti, a causa della complessità cellulare che esiste all'interno del corpo, attualmente non esiste un processo di riscaldamento. In linea teorica, tuttavia, queste sono probabilmente alcune delle sfide che uno scienziato dovrebbe affrontare durante il riscaldamento di un paziente criopreservato .
Per evitare danni, cellule diverse richiedono temperature e procedure di riscaldamento diverse. Questo aspetto è ancora oggetto di studio da parte dei ricercatori. Con la crioconservazione dei pazienti, il rischio di formazione di ghiaccio intracellulare (all'interno) si estende anche a livello intercellulare (tra). Ecco perché l'uso di agenti crioprotettivi e di tecniche di raffreddamento per raggiungere uno stato amorfo simile al vetro è così importante: riduce la formazione di cristalli di ghiaccio, che a sua volta riduce il rischio di danni. Tuttavia, quando si inverte questo processo, i problemi possono tornare. Alcune cellule dell'organismo possono raggiungere la temperatura ottimale prima di altre, aumentando il rischio di formazione di ghiaccio nelle parti più fredde del corpo. Concettualmente, poiché le CPA vengono rimosse e sostituite con fluidi corporei durante il processo di riscaldamento, alcune aree possono andare bene, ma altre possono finire per congelarsi.
Inoltre, alcuni composti presenti nelle CPA sono tossici, quindi il riscaldamento potrebbe essere devastante per la vitalità cellulare complessiva senza la tecnologia per riparare i danni in anticipo. La riparazione dei danni cellulari e la riduzione dell'impatto del riscaldamento non uniforme sono alcuni dei maggiori ostacoli che si frappongono al riscaldamento dei pazienticriopreservato .
Potenziali tecnologie di rilancio future
Sebbene questa tecnologia per riscaldare i pazienti dopo criopreservazione non sia ancora stata sviluppata, si stanno esplorando diverse possibilità per superare le sfide di cui sopra. Due di questi approcci sono i seguenti.
Riparazione cellulare convenzionale
Durante questo processo, l'approccio proposto prevede essenzialmente la scansione di un paziente criopreservato mentre è ancora vetrificato e la registrazione della sua struttura fisica [6]. In questo modo si creerebbe una mappa del corpo, per così dire, per comprendere meglio la disposizione delle cellule e dei vari sistemi quando sono ancora allo stato solido. Poi, durante il riscaldamento, questa mappa permetterebbe di "estrarre rapidamente tutte le molecole metaboliche e degradative e di stabilire rapidamente la biostasi completa alla temperatura più elevata" [6]. In questo modo si risolverebbe il problema generale del riscaldamento non uniforme e si darebbe ai nanorobot medici la possibilità di ripristinare i danni sub-cellulari e riportare le cellule alla loro struttura originale (o migliore) [6].
Ricostruzione molecolare
Un'altra tecnologia proposta che aiuterebbe a riscaldare gli organismi complessi è la ricostruzione molecolare. Poiché i pazienti di criopreservato sono solidi e impenetrabili dai nanorobot (riducendo così la possibilità di mappare e riparare le cellule), è necessario sviluppare un modo per valutare i danni e la struttura. Un modo per farlo è la meccanosintesi, ovvero reazioni chimiche molto mirate a un singolo atomo [6]. Ciò consentirebbe agli scienziati di analizzare un atomo alla volta di un paziente di criopreservato , in modo da registrare la posizione e l'identità precise [6]. Dopo aver registrato ogni atomo, il risultato è una mappa estremamente dettagliata e accurata della struttura fisica del paziente criopreservato , 1000 volte più dettagliata della mappa risultante dalla riparazione cellulare convenzionale [6]. Le scansioni dettagliate consentono di ricostruire il corpo del paziente dopo il riscaldamento, in modo che la nanotecnologia possa effettuare le riparazioni necessarie o applicare altre tecnologie.
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Scansioni distruttive e non distruttive Scansioni non distruttive e ricostruzione
Se la tecnologia esistesse, il sito rianimazione potrebbe essere realizzato dopo la scansione del corpo, utilizzando la riparazione cellulare convenzionale o la ricostruzione molecolare. Ciò potrebbe essere ottenuto attraverso la decostruzione di singoli atomi o una decostruzione più segmentata.
La decostruzione a singolo atomo smonterebbe il paziente atomo per atomo, correggendo digitalmente eventuali danni o problemi medici lungo il percorso [6]. Dopo che ogni atomo originale è stato registrato, viene scartato. Quindi, dopo che tutti gli atomi sono stati registrati, corretti e caricati, si potrebbe produrre un corpo sostitutivo utilizzando la stampa 3D criogenica. Il risultato? Una copia quasi del tutto identica del corpo originale del paziente criopreservato , ma migliore [6].
In alternativa, il corpo dei pazienti di criopreservato potrebbe essere separato in pezzi segmentati (anziché atomo per atomo), in modo che il 99,99999% del corpo solido del paziente sia indisturbato mentre i segmenti isolati vengono elaborati [6]. Questo processo di mappatura non è distruttivo e consente di effettuare riparazioni e correzioni al corpo originale criopreservato [6].
Conclusione
Come si può vedere, il processo di riscaldamento e ottimizzazione della vitalità cellulare è molto più confuso e teorico del riscaldamento di singole cellule. Per ora, a causa di queste sfide, criopreservazione è limitato alle applicazioni attuali. Tuttavia, con il progredire della tecnologia, il riscaldamento di organismi complessi, come organi o addirittura pazienti, diventerà una realtà. Attualmente non esiste nulla di simile, ma chissà cosa succederà nei prossimi 10 o 100 anni.
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Riferimenti
[1] Lab Academy. (2020, 11 ottobre). Come scongelare le cellule - Guida per risultati di crioconservazione più riproducibili - Eppendorf. Eppendorf.
[2] Baust, JM et al. Migliori pratiche per la crioconservazione, lo scongelamento, il recupero e la valutazione delle cellule. Biologia cellulare e dello sviluppo in vitro - Animali 2017.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29098516/
[3]ThermoFisher Scientific. (n.d.). Scongelamento delle cellule - Nozioni di base sulla coltura cellulare Gibco® ..
[4] Eppendorf. (2021). Standardizzazione del protocollo di scongelamento delle cellule - Guida per risultati di crioconservazione più riproducibili. (N. 60).
[5] Bojic, S. (2021, 24 marzo). L'inverno sta arrivando: il futuro di criopreservazione - BMC Biology. BioMed Central.
https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-021-00976-8
[6] Freitas, R. A., & Fahy, G. M. (2022). La rinascita della criostasi: il recupero dei pazienti criogenici attraverso la nanomedicina. (Prima edizione). Fondazione Alcor Life Extension.
